禽白血病病毒（ELISA法）檢測試劑盒

本試劑盒用于禽白血病病毒 P27 抗原的檢測。 本試劑盒是采用雙抗體夾心酶聯(lián)免疫吸附試驗（DAS-ELISA）原理來檢測禽白血病病毒的P27抗原。檢測時，在相應(yīng)的反應(yīng)孔中加入陰、陽對照品和待測樣品，經(jīng)溫育后，若樣品中含有P27抗原，則與酶標(biāo)板上的抗體結(jié)合形成抗原抗體復(fù)合物，反之則不能結(jié)合。洗滌后，加入的酶標(biāo)記物與包被板上的抗原抗體復(fù)合物發(fā)生特異性結(jié)合。再次洗滌后加入底物，酶催化底物反應(yīng)呈現(xiàn)藍色，顏色深淺與樣品中P27抗原的含量成正相關(guān)，從而達到快速檢測的目的。

操作方法

一：禽白血病病毒（ELISA法）檢測試劑盒試劑配制

a）0.01 mol/L pH=7.4 PBS 溶液：準(zhǔn)確稱取氯化鈉 8.0 g、磷酸氫.二鈉1.14 g和磷酸.二氫鉀0.24 g，加入去離子水溶解并定容至1 L。

b）洗滌工作液：使用前，濃縮的洗滌液應(yīng)恢復(fù)至室溫（20-25℃），并搖動，使沉淀溶解（*在37℃恒溫培養(yǎng)箱中加熱5-10 min），然后用蒸餾水作25 倍稀釋（例如：30 mL 的濃縮洗滌液加上 720 mL 蒸餾水）勻，稀釋好的洗滌液2-8℃可存放7日。

二：禽白血病病毒（ELISA法）檢測試劑盒樣品處理

蛋清：取全蛋，破碎后，直接取蛋清100μL。 泄殖腔拭子：取棉簽于待檢雞只泄殖腔取樣，然后放入1 mL PBS溶液（0.01mol/L，pH 值 7.4）中，-20℃以下冰箱中凍融一次，待其恢復(fù)至室溫后，取 100 μL 進行檢測。 疫苗：疫苗稀釋液將疫苗溶解，再用0.01 mol/L pH=7.4 PBS稀釋10-20倍后，取100μL進行檢測。 胎糞：無需稀釋，可以直接用于檢測，若樣品中含有沉淀或雜質(zhì)，需在2000-3000 r/min，離心 10 min，取 100 μL 上清進行檢測。

三：操作步驟

取酶標(biāo)板（根據(jù)樣品*，可拆開分次使用），陰性對照、陽性對照和待檢樣品各取100 μL加至相應(yīng)微孔中，蓋好蓋板膜，輕輕振蕩酶標(biāo)板10 s，充分混

勻，室溫下（25±2℃）避光反應(yīng)60 min。

注：陰、陽性對照各設(shè)2孔，待檢樣品設(shè)1孔。

禽白血病病毒（ELISA法）檢測試劑盒甩掉孔中的溶液，每孔加入稀釋好的洗滌液300μL，震蕩洗滌4次，每次30s 左右，在干凈吸水紙上拍打去除殘存洗滌液。 每孔加入100μL酶標(biāo)記物工作液，蓋好蓋板膜，室溫下（25±2℃）避光反應(yīng)60 min。 棄去孔中的溶液，洗滌4次，方法同2。 底物A液與底物B液按1:1混合均勻，加入孔中，100 μL/孔，蓋上蓋板膜，室溫下（25±2℃）反應(yīng)15 min。

注：底物工作液也可提前配制，但配制完后需5 min內(nèi)使用。

每孔加入終止液100μL，5 min內(nèi)測定結(jié)果。

注：若終止液出現(xiàn)絮狀結(jié)晶，可37℃加熱，待其溶解后使用。

結(jié)果判定

在酶標(biāo)儀上讀各孔OD650nm值，計算出陰性對照孔OD均值NC和陽性對照孔OD均值PC。

注：NC值＜0.200且0.500＜PC值≤2.000，試驗結(jié)果才有效。否則，應(yīng)進行重復(fù)試驗。

按照公式計算出S/P值：S/P=（SC-NC）/（PC-NC）。

注：SC為被檢樣品孔OD值。

如果S/P＜0.17，說明樣品中無禽白血病病毒P27蛋白；如果S/P≥0.17，說明樣品中有禽白血病病毒P27蛋白。

有效期

貯存方法： 2 - 8oC下貯存。

有效期： 12個月。